天然抗原,IVD研发的梦中情人

添加时间:2021年2月26日

1、体外诊断试剂的关键砝码

     IVD核心原材料的品质是决定体外诊断试剂质量的最重要因素,是IVD产业发展与创新的基础,也是体外诊断产业上游最重要的战略节点。

体外诊断试剂的产品研发在技术层面有三大要素——研发思路、工艺体系和关键原材料。关键原材料是诊断试剂灵敏度和特异性的基础,决定试剂质量的下限。工艺体系确保把试剂质量最大限度释放,锦上添花。研发思路可以确保最快实现预期。

当前,诊断技术发展迅猛且日趋成熟,在既有诊断技术条件下,思路和体系的变化空间有限,提升质量的关键砝码是高品质的原材料。

合适的原材料(如抗原)与临床样本中抗体的适配性高。在抗体检测中,其检出目标抗体的可能性更大。抗原表位是联系机体免疫应答与体外免疫反应关键要素。

此外,筛选原材料环节约占诊断试剂产品的研发样机一半的时间。

因此,选择合适的原材料提供正确的抗原表位,可以提高试剂质量的上限,缩短研发周期,事半功倍。

我们探究为何抗原表位在免疫诊断中如此关键。

2、抗原表位——连接免疫原性和免疫反应性的大门

众所周知,抗原有两个基本特性——免疫原性和免疫反应性。

免疫原性:抗原诱导机体产生免疫应答,其中致使B淋巴细胞产生特异性抗体。

免疫反应性:抗原与其所诱导产生的抗体或致敏淋巴细胞特异性结合的能力。

我们通过3张图来了解免疫原性与免疫反应性的联系。

图1,展示了机体免疫应答与体外免疫反应之间的联系。抗原刺激B淋巴细胞分泌特异性抗体,同时也和该抗体结合。在诊断中,前一个过程发生在体内,后一个过程发生在体外。这两个过程要求抗原提供相同或高度相似的抗原表位。上文提到体外诊断试剂的灵敏度与特异性,均与此息息相关。

图2,展示了机体如何产生针对不同抗原表位的抗体。通过MHC分子机制,抗原表位信息可以准确传递到淋巴细胞。通过系列反馈与调控,任何细微结构差异,均可以产生对应的特异性抗体。

图3,展示了抗体如何在体外识别抗原表位。抗原表位可以分为线性表位和构象表位两大类。其中,每类表位又由于氨基酸种类、蛋白修饰方式等不同而结构差异,就好像“密码”。抗原和抗体通过这些“密码”对号入座,特异性结合。

小结:

抗原有两个基本特性:免疫原性和免疫反应性。抗原表位是连接这两个特性的大门。抗原表位相似或相同就是“密码”,一边可以诱导机体免疫应答产生抗体,另一边可以参与体外免疫反应与抗体特异性结合。

3、蛋白质结构及修饰——抗原表位多样性

了解抗原表位,需要先了解蛋白质结构。

如图4,(a)蛋白质多肽链的线性氨基酸序列;(b)依靠不同氨基酸之间的C=O和N-H基团间的氢键形成的稳定结构,主要为α螺旋和β折叠。(c)通过多个二级结构元素在三维空间的排列所形成的一个蛋白质分子的三维结构。(d)由不同多肽链(亚基)间相互作用形成具有功能的蛋白质复合物分子。

蛋白质四级结构的复杂程度呈递进关系,是蛋白质结构的基础。在此基础上,翻译后修饰也会影响蛋白质结构。翻译后修饰的主要类型如表1。不同的翻译后修饰,相同的翻译后修饰作用在不同的蛋白上,均会产生不同的抗原表位,拥有不同的性质。

其中,糖基化修饰是蛋白质连接碳水化合物,存在于细胞表面。据估计,糖基化修饰发生在近50%的蛋白质中。它们在免疫识别和受体结合中起关键作用。

结构产生轻微差异的抗原表位,其与特异性抗体结合的能力也不同。在Nouredine Behloul关于戊肝病毒(HEV)衣壳蛋白的研究中,四个基因型之间仅有少量氨基酸不同,但是与免疫血清反应的效价差异较大。说明了结构差异会导至免疫反应性不同。

随着机体免疫应答的时间推移,优势表位逐渐占据上风,可以持续刺激产生抗体。在体外诊断中,应该重视优势表位的抗体检测。Maria Söderlund等人关于细小病毒B19临床样本的抗体类型研究,将原发感染后的随访血清与先前感染者的样本进行比较。发现急性和早期恢复期的IgG反应针对VP2蛋白的构象表位和线性表位。6个月后,线性表位的抗体突然消失,但是构象表位的抗体仍然存在。说明细小病毒B19 VP2蛋白的构象表位可以刺激机体更长时间。

小结:

蛋白质的氨基酸排列顺序和翻译后修饰可以产生丰富的抗原表位。基于特异性反应,正确的抗原表位是抗体检测的必备条件。此外,相对于线性表位,构象表位作为优势表位,持续刺激机体的时间更长,是体外诊断中的重要关注对象。

4、体外诊断试剂中抗原的选择

在体外诊断中,天然抗原和重组抗原之间的选择应由预期的下游应用决定。如果开发免疫诊断测试,则天然抗原更合适。这是因为天然抗原将与临床样本中的相同抗原具有相似的特性,与抗体适配性高,检出样本中目标抗体的可能性更大。

在体外诊断试剂中,比如降钙素原(PCT)项目,其多肽结构相对简单,线性表位居多。在诊断中如作为参考品,对蛋白结构的要求相对低。

对于蛋白结构复杂的项目如病原体(病毒、细菌、寄生虫等),翻译后修饰的种类多样,蛋白结构复杂,抗原表位丰富。在免疫诊断中对蛋白质原材料的要求更高。如图5、图6。天然抗原可以提供丰富且正确的抗原表位,应用在抗体检测中可以保障灵敏度和特异性。

图5,巨细胞病毒是大型复杂包膜病毒。病毒体由一个二十面体衣壳组成,周围包裹含糖蛋白的细胞脂质层,抗原表位丰富。

图6,细菌的典型结构。细菌细胞壁是复杂的网状结构,细胞壁主要由肽聚糖(PG)组成,通过短肽桥交联在一起。

当前,免疫原料中天然蛋白与重组蛋白共存。两者各有优势,相得益彰。天然蛋白尤其是病原体类天然蛋白更加珍贵。出于生物安全考虑,天然蛋白的生产管控尤其严格。

即将实施的《中华人民共和国生物安全法》强调:把生物安全纳入国家安全战略,建立健全生物安全法律法规体系,加强对病原微生物实验室的安全管理。

国务院在2018年修订《病原微生物实验室生物安全管理条例》,依照实验室生物安全国家标准的规定,将实验室分为一级、二级、三级和四级。明确规定:从事某种高致病性病原微生物或者疑似高致病性病原微生物实验活动,须在P3或以上等级实验室进行。

目前中国有P3实验室40余个,分布在疾控、科研院所、高校、海关和医院等单位,极少用于商业用途。商品化天然抗原来源少,是制约其广泛应用的一大因素。

总结:

抗原的免疫原性和免疫反应性密切关联。抗原表位是连接两者的大门。在临床诊断中,使用具有与引起免疫应答相同表位的抗原,能够提高检出目标抗体的概率。

蛋白质的氨基酸排列顺序及翻译后修饰遵循一套复杂的机制。任何细微的偏差,都可能引起连锁反应,改变蛋白质结构,导至抗原表位变化。

天然抗原拥有抗原本身的结构,抗原表位丰富且正确,可以提高诊断的灵敏度和特异性,是免疫诊断试剂的理想材料。

德国维润赛润拥有生物安全三级实验室(P3实验室),对天然抗原尤其是传染病类抗原有丰富的研究和生产经验,为IVD生产企业及相关医疗和科研单位提供最优质的天然抗原产品及整体解决方案。

公司官网:https://www.virion-serion.net/

产品咨询:18818686988 / 0755-89381139

参考文献:

【1】The structural basis of antibody-antigen recognition.

【2】On the binding affinity of macromolecular interactions:daring to ask why proteins interact.

【3】Fundamentals and Methods for T- and B-Cell EpitopePrediction.

【4】Recent Progress in Chemical Modification of Proteins.

【5】Comparison of natural and recombinant tissue factorproteins: new insights.