Cell重磅 | 超越张锋等人发明的技术!诺奖获得者Doudna等人升级新冠病毒检测技术:无需扩增病毒RNA与只要一台手机即可

添加时间:2020年12月8日

2019年12月爆发的新型呼吸道病毒SARS-CoV-2已成为全球性的大流行病,部分原因是要确定该病毒引起的症状,无症状和症状前携带者。CRISPR诊断程序可以快速,便携和准确地进行,因此可以增强金标准的基于PCR的测试。 

2020年12月4日,Melanie Ott,Daniel A. Fletcher及Jennifer A. Doudna等人在Cell 在线发表题为“Amplification-free detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas13a and mobile phone microscopy”的研究论文,该研究报告了一种免扩增的CRISPR-Cas13a检测技术的发展,该检测技术可直接从鼻拭子RNA中直接检测SARS-CoV-2,可通过手机显微镜对其进行读取。 

该测定法在30分钟的测量时间内即可达到约100拷贝/μL的灵敏度,并能在5分钟内准确地检测出一组阳性临床样品中的预提取RNA。该研究结合靶向SARS-CoV-2 RNA的crRNA来提高敏感性和特异性,并使用酶动力学直接定量病毒载量。与基于手机的阅读器设备集成后,该检测方法有可能实现SARS-CoV-2的快速,低成本,即时检查。

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在2019年末,人群中出现了一种新型的传染性呼吸道RNA病毒SARS)-冠状CoV-2。在大多数人中,SARS-CoV-2感染可导致轻度或无症状。但是,至关重要的是,无症状或症状较轻的携带者传播了该病毒,导致携带者的隔离延迟和在世界范围内传播。特别地,这种传播已导致由于年龄或诸如肥胖,糖尿病,癌症,免疫抑制或心脏,肺部和肾脏疾病之类的既存疾病而导致严重疾病风险增加的个体的感染。
目前,SARS-CoV-2感染的金标准诊断方法是定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR),已被广泛确立并广泛用于筛查。基于针对核衣壳(N),包膜(E)和开放阅读框1ab(ORF1ab)基因的引物,RT-qPCR的分析检测限(LOD)为1,000病毒RNA拷贝/ mL(1拷贝/ μL )。
但是,最新的病毒动力学模型表明,需要频繁的快速检测以打破当前的大流行。值得注意的是,该模型将测试的灵敏度列为较低优先级,并估计100,000拷贝/ mL(100拷贝/ μL)的LOD足以进行筛选。尽管对于所需的准确目标LOD尚未达成广泛共识,但频繁的测试和快速的周转时间将允许不太敏感的测试来帮助减少病毒传播。在临床研究中,当病毒载量降至百万拷贝/ mL(1,000拷贝/μL)以下时,几乎没有检测到传染性颗粒,因此传播的风险很低。
对快速,广泛且能够识别传染性个体的SARS-CoV-2检测的需求,促使人们努力探索基于CRISPR技术的病毒RNA检测新策略。Cas12和Cas13蛋白是细菌适应性免疫系统的RNA引导成分,分别直接靶向单链和双链DNA或单链(ss)RNA底物。Cas13与包含可编程间隔子序列的CRISPR RNA(crRNA)结合形成无核酸酶的核糖核蛋白复合物(RNP)。当RNP与互补靶RNA结合时,它会激活Cas13的HEPN基序,然后不加选择地裂解周围的任何ssRNA。可以通过由ssRNA连接的荧光团-猝灭剂对检测靶RNA结合和随后的Cas13裂解活性,该对在激活Cas13裂解后会发出荧光。迄今为止,已经鉴定出四种VI型CRISPR-Cas13亚型:Cas13a(以前称为C2c2),Cas13b,Cas13c和Cas13d。
最初演变为细菌诱导细胞休眠以减少噬菌体传播的成功策略,现在被用于病毒诊断。为了实现高灵敏度,当前的CRISPR诊断(CRISPR Dx)依赖于目标RNA的预扩增,以便随后通过Cas蛋白进行检测。对于RNA敏感的Cas13蛋白,这需要通过逆转录,基于DNA的扩增(即等温扩增,LAMP),以便通过Cas13a或Cas13b,一种名为“ SHERLOCK”的方法。

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文章模式图(图源自Cell 

最近将其改用于SARS-CoV-2检测,并进一步开发为“ SHINE”,用于检测未提取的样品。通过使用DNA感应Cas12进行检测可以避免扩增的DNA转换回RNA,这种方法称为“ DETECTR”,最近已被用于SARS-CoV-2检测。SHERLOCK和DETECTR都需要大约一个小时才能完成,并且尽管适用于FDA批准的当前协议仍是基于实验室的,但仍可以使用适用于即时医疗的纸质侧向流动条进行读取。
在这里,该研究报道了一种基于CRISPR-Cas13a的快速检测方法的开发和演示,可直接检测SARS-CoV-2 RNA。与以前的CRISPR检测不同,该测定不需要预先扩增病毒基因组即可进行检测。通过直接检测病毒RNA而无需进行其他操作,该测试就可以进行定量RNA测量,而不仅仅是简单的阳性或阴性结果。
为了证明该测定法的简便性和便携性,该研究在紧凑型设备中使用手机摄像头测量了荧光,该设备包括低成本的激光照明和采集光学器件。移动电话摄像头的高灵敏度以及它们的连接性,GPS和数据处理功能,使其成为在资源匮乏地区即时诊断疾病的有吸引力的工具。
通过结合多个crRNA来增加Cas13a活化并分析荧光随时间的变化,而不是仅分析终点荧光。该研究还可以在设备上测量时间的5分钟内正确识别出所有测试的SARS-CoV-2阳性患者RNA样品(Ct值14.37至22.13)。这种方法有可能为护理点SARS-CoV-2筛查提供快速,准确,便携式和低成本的选择。

参考消息:https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.12.001

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精雕细琢,工匠精神 ——维润赛润隆重推出“经临床验证”的SARS-CoV-2抗原编辑:Steven | 校对:Harris | 责编:Hillson

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